2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）是一种有机化合物，属于D类化学物质，可能对人类致癌。它是农业中应用最广泛的除草剂，用于作物和非作物的阔叶除草。2,4-D会对生物系统产生负面影响，对人类造成不利健康的影响。这些影响对基因表达的负面影响通过触发应激反应破坏细胞周期控制、免疫反应和DNA修复。研究发现，暴露在2,4-D下可降低红细胞中还原性谷胱甘肽的水平，并显著改变抗氧化酶的活性。在水生生态系统中，2,4-D已被报道对斑马鱼(Daniorerio)的胚胎发育有影响。

目前，现有的2,4-D检测方法需要多步样品制备和昂贵的仪器。使用全细胞生物传感器是一种有趣的方法。该研究基于根瘤菌的cadA启动子和cadR调节因子，构建了一个基于基因的根癌农杆菌生物传感器。菌株HW13(2,4-D降解剂)，以甲酰甘氨酸生成酶(FGE)-硫酸酯酶为报告基因。这种新型生物传感器在简单存储条件下具有高稳定性，作为一种廉价、易于使用的工具筛选环境污染源的潜力。

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实验原理

在2,4-D存在的情况下，cadR被激活，导致pMPcadA-patsBA融合的转录，该融合表达一种硫酸酯酶，裂解4-MUS，导致紫外光下的发荧光菌落。

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图1  以硫酸酯酶为报告系统的全细胞基因生物传感器的结构

为了提高生物传感器的灵敏度，通过容易出错的PCR(ep-PCR)突变了cadR。通过硫酸酯酶活性测定，分离出18个在含有12.5μM 2,4-D的LB琼脂培养基上的发荧光的突变体。

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图2  野生型和各种cadR突变体暴露于12.5μM 2,4-D时的硫酸酯酶活性。星号表示克隆（37和53）作为进一步研究的候选克隆

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实验结果

比较野生型和突变型cadR生物传感器的硫酸酯酶活性，发现BR37和BR53对野生型cadR的2,4-D浓度的检测限为12.5μM、1.56μM（比野生型提高了8倍）；对4-CPAA和4-MPAA的反应也有相同的敏感性。与野生型相比，cadR突变体(BR37和BR53)的诱导倍数分别增加了2.02倍和3.19倍；BR37和BR53在1.56μM时的诱导率分别增加了3.43倍和4.43倍。

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图3  野生型cadR和两种cadR突变体生物传感器暴露于2,4-D(A)、4-CPAA(B)和4-MPAA(C)生物传感器时的相对荧光强度。突变体cadR系统能够在1.56μM时对2,4-D、4-CPAA和4-MPAA产生反应

来自BR37的BR95(分别含有E39K和E321K突变和BR95)在对2,4-D的敏感性方面并没有优于BR37。BR55和BR95明显低于BR53。

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图4  野生型和突变型cadR生物传感器的根癌农杆菌NTL4暴露于0~50μM的２,４－Ｄ浓度下的硫酸酯酶活性

为了研究系统的特异性，将生物传感器暴露于内分泌干扰剂BPA和有机磷农药CPF（毒死蜱）中，这是常见的环境污染物。野生型生物传感器暴露于100μM BPA、CPF和2,4-D时的荧光强度如图所示。表明开发了一种新的基于基因的全细胞生物传感器，对2,4-D具有特异性和敏感性。

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图5  野生型和cadR突变体生物传感器暴露于双酚A(BPA)和有机磷农药毒死蜱(CPF)在100μM时的硫酸酯酶活性

将100μM 4-MUS与不同浓度的2,4-D一起加入，在28°C下孵育过夜。结果显示，与使用去离子水的对照组相比，该生物传感器可以检测到2,4-Ｄ，而不受环境水中其他复杂化合物的干扰。

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图6  以去离子水作为对照的全细胞生物传感器检测环境样品中的2,4－D

在4°C的LB肉汤中保存后，对生物传感器性能进行评价。每5天用硫酸酯酶测定法检测一次生物传感器的活性。在储存30天后，当暴露于100μM 2,4-D时，活性保持在82%，使其成为一种很有前途的替代方法，可用于检测环境中的2,4-D污染。保存在含有15%甘油的LB培养基中的生物传感器的荧光强度与不含甘油的LB培养基中的荧光强度没有显著差异。

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图7  该生物传感器在含15%甘油的LB中储存和不含15%甘油，在4°C下储存52天后的稳定性比较

评价：

１.  创新性强，提出基于基因的生物传感器，材料易获得，成本较低；

２.  通过检测荧光强度来衡量２,４－Ｄ的残留浓度，开发成产品可行性高；

３.  通过突变ｃａｄＲ，提高检测灵敏渡，从微观层面，体现了分子之间特异性结合的高效性。启发适配体的点突变可能会增加其特异性的可能，启示未来的研究会集中于分子间特异性结合；

４.该方法所构建的生物适配体，保留时间长，而且检测稳定性好。

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参考文献：

Benjarat Ritcharoon, Ratiboot Sallabhan, Neal Toewiwat, Skorn Mongkolsuk, Suvit Loprasert,Detect

ion of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid herbicide using a FGE-sulfatase based whole-cell Agrobacterium biosensor,Journal of Microbiological Methods,Volume 175,2020,105997.