引言

人类卵子在母体输卵管中经过受精形成胚胎，一周后植入子宫。这期间胚胎会从2细胞时期逐渐发育成被透明带包裹的具有空腔的结构-囊胚。由于人类胚胎的伦理限制，围植入期的真实人类胚胎难以获取，越来越多的科学家尝试利用干细胞构建类似于人类囊胚、原肠胚的结构以期望作为可靠的研究模型代替人类胚胎的使用。2021年已经涌现出5篇文章以各种不同构建策略产生人类囊胚类似结构，但都存在形成效率低，早期胚胎的三个起始谱系（Epiblast,  Trophoblast, Primitive endoderm）不能同时表达或表达不正确的现象。本次小编推送的文章“Human blastoids model blastocyst development and implantation”，由奥地利科学院的Nicolas Rivron团队完成。其对Naïve状态的人类多能干细胞（hPSCs）抑制三条信号通路，使构建的类囊胚结构与人类囊胚发育的时间顺序相似，有效地形成3个起始谱系。在类囊胚结构中，上胚层（Epiblast, EPI）类似物可以自发地诱导极滋养层（polar Trophoblast, pTE）类似物成熟，从而使类囊胚获得类似于人类真实囊胚的着床能力。总之，本文建立了一种可靠的、可扩展的、合乎伦理的囊胚模型来探索人类胚胎的植入与发育过程。

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对Naïve状态的hPSC通路进行抑制

人类胚胎受精后4天，受精卵形成桑葚胚，桑葚胚产生空腔化形成囊胚。囊胚的发育（5-7 d.p.f.）支持3个起始谱系的产生，其分别是：未来形成胚胎部分的上胚层(EPI)，未来形成胎儿胎盘的滋养外胚层(Trophoblast, TE)和未来形成卵黄囊的原始内胚层(Primitive endoderm, PrE)。根据之前的报道，通过抑制Hippo通路，人类囊胚外围的细胞具有发育为TE的命运；在PXGL培养基体系中Naïve状态的hPSCs通过抑制TGF-β和ERK通路也可以有效形成TE类似物。因此，研究团队结合以上两点，在非粘附的水凝胶微孔中聚集了hPSCs，并在PXGL培养基中添加了溶血磷脂酸(LPA, Hippo通路抑制剂) 、A83-01 (TGF-β家族受体抑制剂) 、PD0325901 (ERK抑制剂)、 LIF (STAT激活剂)和 Y-27632 (ROCK抑制剂)成分，同时抑制了Hippo、TGF-β和ERK三条信号通路（其中LPA对形成效率的提升至关重要）。经过96 h培养，该类囊胚结构的总体细胞数量由47±9增长到129±27，总体直径大小由65μm增长到200μm，这与5-7 d.p.f.囊胚的增幅一致。其中，类似于TE 谱系的细胞（GATA2+, GATA3+, CDX2+, TROP2+）在经历扩张与收缩的过程中进行了增殖，建立了粘附连接（CDH1+），顶端极性（aPKC定位）和紧密连接（ZO-1+）; 类囊胚结构都可以分离出内部细胞簇，其具有类似于EPI谱系的细胞（OCT4+，占总数26%）和类似于PrE谱系的细胞（GATA4+, SOX17+, PDGFRa+，占总数7%）。研究团队同时也测定了多种Naïve状态的hPSCs系（包括Shef6, H9, HNES1, niPSC 16.2.b, cR-NCRM2），均能以较高效率形成类囊胚结构，但Primed状态的hPSCs系不能形成该结构。

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图1. 三重抑制的Naïve hPSCs可以有效地形成含EPI、TE、PrE类似物的人类囊胚样结构

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囊胚类似物的形成

接下来研究团队对该类囊胚结构进行利用单细胞转录组测序，根据数据分析得出其具有三个初始谱系的特异基因标记，包括TE（GATA2/GATA3）、EPI（OCT4/KLF17）、PrE（GATA4/SOX17）。再结合体外培养囊胚和原肠胚的转录组数据进行比较，发现类囊胚结构总体上与人类胚胎的囊胚阶段相似，与植入后胚胎明显不同。接下来利用更高分辨率的聚类分析（x50），研究团队发现部分亚群（<3%）具有类似于植入后组织的状态（根据GABRP, ISL1, APLNR, CRABP2筛选），包括转录水平类似于羊膜和胚外中胚层的细胞簇。

利用以前报道过的干细胞转录组数据进行对比，分别关注每个谱系：① 类似TE谱系的细胞多能性状态位于Naïve hPSCs与植入后状态的滋养层干细胞（hTSCs）之间，并富集囊胚期TE转录标志物（ESRRB, GRHL1, GATA2, GATA3, TBX3, KRT19, CGA, CGB5, CGB7），不富集植入后滋养层标记物；② 类似EPI谱系的细胞多能性状态类似于Naïve hPSCs，并富集囊胚期EPI转录标志物（KLF17, ATG2A, SUSD2, TFCP2L1, ZFP57, DPPA2, UTF1, PRDM14），与Primed状态的hPSCs明显不同；③ 类似PrE谱系的细胞多能性状态位于Naïve hPSCs与胚外内胚层细胞（nEND）之间，并富集囊胚期PrE的标记物（GATA6, MSX2, HNF4A, PDGFRA, GATA4, SOX17, HNF1B, FOXA2），下调EPI的转录标志物（ARGFX, PRDM14, SOX2, NANOG, DPPA2, OCT4）。

囊胚具有建立干细胞系的能力，所以接下来研究团队利用囊胚样结构尝试构建干细胞系。Naïve hPSCs可以从头构建，并能够再次形成囊胚样结构；hTSCs也可以构建，并具有分化为合胞体滋养层（STB）和绒毛外滋养层细胞（EVT）的能力；PrE细胞系目前未有稳定建立方法。综上所述，97%以上的细胞相似的类囊胚结构可以看作囊胚期细胞类似物。

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图2. 利用单细胞转录组数据说明人类囊胚样结构形成了植入前胚胎EPI、TE、PE三个谱系类似物

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Hippo通路的抑制是极其重要的

在人类囊胚谱系分离的过程中，Hippo通路的抑制可以使外周极性的细胞启动向TE分化的命运。所以研究团队又在类囊胚结构测试这一机制。根据免疫荧光结果发现：aPKC和F-actin在外周的TE类似细胞中出现协同表达，同时这些细胞的核内积累了Hippo通路下游效应器YAP1，且与GATA2/3表达相关联，与NANOG表达互斥。利用CRT0103390（aPKC抑制剂）处理可以阻止YAP1在细胞核中的积累，减少GATA3的表达；抑制Hippo通路的LPA受体和配体（LPA和NAEPA）反而增强了囊胚样结构的形成。Hippo通路的抑制会使YAP1进入细胞核，而YAP1和TEAD之间的相互作用是下游基因调控所必需的。所以接下来团队过表达并对比了野生型样本（5SA）、突变TEAD结合位点（S94A）样本和Verteporfin（破坏YAP1-TEAD相互作用的药物）处理的样本。结果表明，过表达使5SA样本空腔化过程加速、不影响S94A的空腔化过程、而药物处理样本不能形成类囊胚结构。空腔化形态的发生是通过多个含液体的空腔合并形成的，而水通道蛋白3（AQP3）是人类囊胚中表达最高的水转运蛋白。所以，研究团队在囊胚样结构中观察其表达，发现36h在所有细胞中均能表达，而96h仅在类似TE谱系的细胞中表达。综合以上实验结果表明：囊胚样结构与真实人类囊胚空腔化机制一致，在TE的谱系形成上同样依赖于aPKC、Hippo通路的抑制、YAP1入核表达及其与转录因子TEAD结合的能力。

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合理的发育顺序

人类囊胚中，TE与EPI在5-6 d.p.f.时期最先出现，PrE和pTE在6-7 d.p.f.时期稍晚出现。在类囊胚结构也按照这个顺序：① 24 h内TE类似谱系（DAB2+, CDX2+, GATA2+/3+）首先形成，同时PKC和Hippo信号相关基因在转录水平被改变（AKAP12, CAPZB, ULK4, MOB1a, AMOT, AMOTL2, LATS2, TEAD1）；在蛋白质水平上，24 h时期TE类似谱系具有YAP1核内表达和GATA2表达，60 h时期具有CDX2/GATA3表达并维持KLF17/OCT4活性（无NANOG表达），随后OCT4退出表达。这一过程中与SMAD、ERK、Notch和Wnt信号通路相关的基因受到调控。60 h后，pTE类似谱系表达标记物OVOL1、GREM2、CCR7、SP6和NR2F2（NR2F2, CCR711上调，CDX2下调）；② EPI类似谱系保持核心多能性标记（POU5F1, NANOG, KLF17, SUSD2, KLF4, ARGFX, GDF3），同时具有经历调节Nodal（Nodal, LEFTY1/2）、mTOR信号相关基因（LAMTOR1/4/5, XBP1, SEC13, MLST8）和X染色体激活相关基因XACT为特征的超时进展；③ PrE类似谱系在60 h内出现，72 h具有GATA4、OTX2和SOX17的表达。早期PrE标记物（GATA6, LBH, ADM, LAMA1）在PrE类似谱系中均匀表达，而晚期PrE标记物（CTSE, APOA1, PITX2, SLCO2A1）仅在其中一个细胞亚群中表达，这说明了此过程正向囊胚晚期过渡。96 h时期，成熟的PrE类似谱系调控SMAD和Wnt信号通路相关基因（NODAL, BMP2/6, WNT3, ID1/2），并富集细胞外基质组织（LAMA1, LAMB1, LAMC1, COL4A1/2）内胚层和上皮分化的基因。

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图3. 类囊胚结构的三个谱系可以按照囊胚发育的顺序和时间形成

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类囊胚可以显著地与子宫内膜细胞附着

人类囊胚在7 d.p.f. 时期通过TE附着在子宫内膜上并进行植入。那么在类囊胚结构中是否能够模拟植入过程呢？因此，研究团队在2D条件下种植了子宫内膜类器官，以形成一个开放的子宫内膜层（OFEL）来促进类囊胚结构的植入，并利用乙酰化α-微管蛋白和FOXA2分别标记OFEL中的纤毛上皮与腺上皮细胞亚群。根据以前的研究，在人类母体中，雌激素（E2）、孕酮（P4）和Wnt信号共同作用下，子宫会出现接受囊胚着床的窗口期。因此，研究团队利用E2、P4、cAMP和XAV939（Wnt/β-catenin通路抑制剂）对OFEL进行处理，使其出现接受着床的生物学事件，包括上调分泌中期子宫内膜标记基因的表达和减少增殖。实验结果表明，类似于人体子宫中的附着事件，类囊胚结构只在处理过的OFEL上进行附着，并且在Levonorgestrel（避孕药）处理下会破坏这种附着状态。综上所述，类囊胚结构可以显著地与子宫内膜细胞附着。

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EPI对pTE的信号作用可以保持附着状态

在人类囊胚中，与EPI直接接触的pTE部分会附着在子宫内膜上。而类囊胚结构也能重复这一过程。接下来，研究团队通过形成缺乏EPI的TE来测试pTE与EPI之间相互作用对于胚胎附着的重要性。根据本研究的单细胞转录组数据可知，IL6在pTE中高度富集，同时IL6的受体（IL6R, GP130）和效应子（STAT3）的转录本在EPI类似谱系中大量富集。所以研究人员通过增加LIF浓度并添加SC144（GP130抑制剂）来产生滋养细胞球（trophospheres）；而添加XMU-MP-1（Hippo通路MST1/2激酶的抑制剂）也能产生滋养细胞球。以上两种策略构建的滋养细胞球在转录组水平分别类似于早期和晚期囊胚TE。经过实验发现hPSCs、hTSCs和这两种滋养细胞球均不能与OFELs附着，以上结果说明了来自EPI的信号可以诱导pTE成熟，并赋予其和子宫内膜细胞相互作用的潜力。有趣的是，这种潜力似乎在与植入后TE多能性相似的hTSCs中消失了。研究人员接着提出了几组在OFELs刺激和模拟pTE成熟时上调表达的分子（pTE: PTN, PGF, CAV1, CD63, SDC1; OFEL: DPP4, NRP1, ITGA2, SDC1, ITGA6）。综上实验数据可以得出，EPI会诱导pTE的成熟，EPI对pTE的调控可以保持类囊胚结构与子宫内膜的相互作用。

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模拟D13阶段的人类胚胎

在围植入期的培养条件下，类囊胚结构的形态可以维持两天。胚胎在植入后合胞体滋养层会分泌CGβ（β样绒毛膜促性腺激素），而临床上通过检测CGβ水平来判断是否妊娠，所以研究团队分别用标准妊娠试验和ELISA检测植入后类囊胚结构是否会分泌CGβ。同时根据实验数据，表达NR2F2的pTE可以增殖并降低CDX2表达，升高CK7表达（着床期基因）。部分滋养层细胞进一步分化为STB和EVT（分别表达CGβ和HLA-G）；EPI类似谱系在上皮化过程中维持OCT4、SOX2表达并升高Primed多能性标志物CD24和皮层表达的F-actin；一些类囊胚结构中形成富含F-actin、PODXL、aPKC的原羊膜样腔成分。此外EPI类似谱系周围的亚群同时表达CDX2和SOX2（或TFAP2C），这可能是类早期羊膜细胞。在延长培养时间（6天）后，三个谱系持续扩增到D13状态。尽管该过程与囊胚相似，但是它的组织结构并未反映出发育进程。

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图4. 类囊胚结构可以重现着床的多个方面

讨论

本研究构建的人类囊胚类似结构在形态上类似于人类囊胚、在谱系分化上可以有效生成三个谱系细胞的类似物、在转录组层面上与人类植入前囊胚阶段接近、在发育进程上可以按相似速度模拟真实囊胚的发育顺序。此外，给模型还可以研究人类囊胚的着床、模拟EPI和pTE之间的相互作用。不足之处在于还没有真正的模拟囊胚植入后的发育。

未来类囊胚可能在确定治疗靶点、临床前建模、母胎交流机制研究等方面发挥。作为今年第6篇人类类囊胚体系构建的研究文章，类胚胎领域已经成为当今的研究热点，这体现了领域内对于体外生命孕育可能性的探索。我们可以预见类胚胎将会成为一种可靠、可量产、可合乎伦理的人类胚胎研究模型。

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