Affinity-Purification

抗原亲和纯化（Affinity-Purification ）是基于抗原 - 抗体可逆结合的特性产生的一种纯化免疫球蛋白的方法，通过交联到树脂上的抗原，纯化出与抗原有特异性反应的抗体，这一纯化方法大量的去除了非特异性的免疫球蛋白成分，得到的抗体特异性更高。  

抗原亲和柱制备

1.物料和试剂

1.1、 CNBr-activated Sepharase 4B，GE Healthcare

1.2、1mM HCL

1.3、1L连接缓冲液

1.4、封闭液: 0.5M 乙醇胺，0.5M NaCl pH 8.0

1.5、pH4.0洗涤液：

1.6、pH8.0洗涤液：

1.7、PBS缓冲液：

2. 操作流程

2.1、预处理 CNBr-activated Sepharase 4B：称取适量 CNBr-activated Sepharase 4B干粉（ 1mg冻干粉可得到3.5mlbeads，通常1mlbeads能结合5-10mg蛋白），放入预冷1mM HCL的烧杯中置于4度15分钟。等体积分装beads于亲和纯化柱中，按照1ml beads 200ml1mM HCL洗涤。然后抽干残留HCL。

2.2、将溶解处理好的蛋白或是多肽加入适量coupling buffer，然后加入装有beads的纯化柱。同时在两种条件下孵育：室温孵育3-4小时，4度孵育过夜。

2.3、孵育结束后用coupling buffer洗涤连接好的beads3次，然后加入封闭液，1mlbeads加8ml封闭液。4度过夜或是室温4小时。

2.4、流出封闭液，用coupling buffer洗涤3次后，分别用PH4.0和PH8.0的酸碱交替洗涤3次。

2.5、洗好的beads加入20%乙醇的PBS放4度备用。

 亲和纯化步骤

1，物料和试剂

1.1、PBS缓冲液：

1.2、磷酸中和液：

1.3、洗脱液：

1.4、考马斯亮蓝：100mg 考马斯G-250，50ml 乙醇，100ml 磷酸。

2 操作流程

2.1、4℃解冻血清后，浸入56度水浴锅30分钟，保证血清液面在水浴里面。

2.2、4℃，3500rpm，离心20分钟。

2.3、用移液器将离心好的血清表面的脂类吸出，取上清，留30-50ul血清小样ELISA检测。

2.4、将准备好的柱子和血清进行孵育，室温1.5小时，室温低时可置于30℃水浴锅。

2.5、孵育完成后用PBS洗涤3次，每次10倍柱体积。

2.6、洗脱：用pH5.0的150 mM甘氨酸预洗脱5-10ml，再用预冷的pH2.5洗脱液洗脱，每次收集1ml，EP管或是96孔收集板中预先加入50ul中和液。

2.7、将收集液用考马斯检测收集峰，100 ul考马斯中加入3.3 ul收集液，并根据收集峰判断直接收集和需要浓缩的抗体，并分开保存。

2.8、考马斯检测没有颜色的时候终止收集，用10 mlPBS洗涤，然后重复孵育洗脱直到没有收集峰出现。取50 ul FT留样做ELISA 。

2.9、将收集的低浓度抗体用PEG浓缩或是ProA浓缩。

2.10、按要求保存抗体.