ELISA

酶联免疫吸附试验（ Enzyme Linked Immunosorbent Assay， ELISA）是目前应用最广泛的免疫学检测技术，是将抗原 - 抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后的显色反应判定结果。一般用酶标测定仪测定吸光度（ OD 值）来反映抗原或抗体含量，灵敏度可达每毫升纳克（ ng）水平甚至皮克（ pg）水平。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
目前常用的 ELISA 方法有直接法、间接法、双抗夹心法、竞争法 ELISA。此处介绍双抗夹心 ELISA 操作步骤。

ELISA实验步骤：

1 设备/材料

1.1 包被液

1.2 ELISA洗涤液：

1.3 封闭液和稀释液：PBST+5%脱脂奶粉

1.4 一抗

1.5 酶标二抗

1.6 TMB显色液（A液） ：

1.7 TMB显色液（B液）：

2  操作流程

2.1 准备：

查抗原信息找出对应的抗原，根据要检测血清和抗体的样本数量决定包被抗原的板条数，从而算出需要的包被液的数量，然后把包被液加入EP管，并做好标记，ELISA检测板条装好，并做好标记。

2.2 包被：

根据每个抗原浓度，将抗原小样加到对应的有包被液的EP管中，使其稀释后的浓度均为3 ng/ul，稀释之后，将包被液加入相应准备好的酶标板条中，酶标孔每孔加50 ul包被液，每加完一块板盖上盖子，以免被污染，恒温37℃摇床2h或者4℃过夜。

2.3 封闭：

取出酶标板，倒掉里面的溶液，用PBST冲一遍，摇床洗一遍（5min），拍干，用封闭液（PBS配制的5%脱脂奶粉溶液）每孔加200 ul，恒温37℃摇床1h或者4℃过夜，之后用PBST冲一遍摇床洗一遍（5 min）。

2.4 加一抗:

按照需要将一抗做梯度稀释，100ul每孔恒温37℃孵育2小时或是4度过夜。

2.5 加二抗:

先配制适当体积的二抗（二抗稀释度为1:100000）；倒掉一抗，PBST先冲一遍，摇床洗三遍，每遍5 min，拍干。每孔加入100 ul二抗；37℃摇床1 h。

2.6 显色：

倒掉二抗，先PBST冲一遍，摇床洗三遍，每遍5 min，拍干；戴手套，TMB A液：TMB B液=1:1配置合适体积，混匀（现配现用）；每孔加100 ul，等待大约10min，蓝色比较清晰，稳定，可以读数记录，记录每条显色的孔数。