ChIP

染色质免疫沉淀（ChIP）是一种研究蛋白质与染色质DNA相互作用的技术,根据不同目的既可用于鉴定互作蛋白，也可用于鉴定互作DNA。通常被用于表观遗传血研究，如通过ChIP检测转录调节相关的组蛋白修饰。

操作步骤：

1.  样品准备（操作样品在冰上或4℃进行。）

• 对于悬浮细胞, 确保10 ml新鲜培养基中有合适数量的细胞，直接加37%甲醛至终浓度为1%。摇晃混匀后，室温下摇床孵育10 min。

• 对于组织, 液氮充分研磨组织至粉末状。然后转移至15 ml或50 ml尖底管中，加入10 ml PBS和 270 μl 37%甲醛至终浓度为1%。摇晃混匀后，室温下摇床孵育10 min。

1.1、加入500 ul 2.5 M甘氨酸（至终浓度0.125 M）终止反应，室温孵育5 min。

1.2、细胞转至50 ml尖底管中，4℃、2500 rpm离心5 min。

1.3、弃上清，冰预冷PBS（pH 7.4）洗涤细胞2次，每次洗涤后4℃、2500 rpm离心5 min。

1.4、用1 ml冰预冷细胞裂解液（现加蛋白酶抑制剂），重悬细胞。为促进细胞膜的破裂，用Douncer玻璃匀浆器匀浆细胞5~10次，4℃孵育15 min。

1.5、4℃、4000 rpm离心5 min，弃上清。

1.6、细胞裂解液重新细胞核 (每3-5 x 106 个细胞加100 ul裂解液)。

1.7、冰上超声5~15 min(25%功率，超声20s、停30s)，最佳超声条件需要根据预实验确定。

1.8、4℃、12000 rpm离心5 min，转移上清至新EP管中，直接进行后续试验，或冻存-20℃备用。

2. DNA断裂效果检测

2.1、取50 ul染色质上清，加入150 ul ddH2O，10 ul 5M NaCl，65 ℃ 4 h或过夜，解交联。

2.2、加入RNaseA至终浓度50 μg/ml，37 ℃孵育30 min。

2.3、加入Proteinase K至终浓度50 μg/ml，42 ℃孵育30 min。

2.4、剂盒纯化DNA片段。

2.5、1.5 %琼脂糖胶电泳检测。

3. 免疫沉淀（按单个CHIP反应）

3.1、准备70 ul磁珠。

3.2、用600 μl含5 %BSA的PBS，洗涤磁珠2次。

3.3、第二次洗涤后，重悬磁珠至初始体积。

3.4、取100 ul细胞裂解物（约含20 ug 染色质，具体因细胞及制样不同而异），1:10稀释至1 ml。

3.5、 取25 ul洗好的磁珠，加至细胞裂解物中，进行lysate 预吸附处理。

3.6、剩余45 ul磁珠，加入2-5 ug相应抗体，4 ℃旋转孵育过夜。（使用非特异性的IgG，作为阴性抗体对照）。

3.7、 将步骤5 中样品，磁性分离，转移预吸附后的lysate至新EP管中。

3.8、用300 ul 冰预冷的 PBS（含5% BSA），洗涤步骤6后的抗体-磁珠复合物2次，弃上清。

3.9、加入预吸附后的lysate（留50 ul冻存备用）至抗体-磁珠复合物中，4 ℃旋转孵育2 h。

3.10、瞬离样品，然后置于磁力架上。

3.11、每次1 ml低盐洗涤液，洗涤2次。

3.12、每次1 ml高盐洗涤液，洗涤2次。

3.13、每次1 ml LiCl洗涤液，洗涤2次。

3.14、每次1 ml TE溶液，洗涤2次。第2次洗涤时，转移样品至新EP管中。

3.15、最后洗涤结束，移液器尽弃洗涤液。

3.16、准备Elution buffer，恒温浴调至65 ℃。

3.17、加入100 ul Elution buffer至每个样品中（步骤15后），65 ℃孵育10 min。

3.18、转移洗脱液至新EP管，并重复步骤17一次，最终收集到200 ul。

3.19、取之前预吸附后的lysate 50 ul，作为 5% Input。补加150 ul Elution buffer，至总体积200 ul。

3.20、分别向CHIP洗脱样品（步骤18后）和Input中加入10 ul NaCl（5 M 母液），65 ℃孵育过夜进行解交联。

4. DNA纯化和分析：

4.1、加入Proteinase K至终浓度50 μg/ml，42 ℃孵育1 h。

4.2、试剂盒纯化DNA片段。

4.3、PCR检测及分析。