IP

免疫沉淀（Immunoprecipitation ，IP ）是利用抗体抗原特性性结合的一种亲和纯化技术，广泛应用于从组织或细胞裂解物中富集、分离天然靶蛋白。

操作步骤

操作样品尽量冰上或4℃进行。

样品准备

可选择与您研究材料相匹配的标准操作流程进行细胞裂解。也可参考Proteintech官网“细胞与组织裂解物制备”操作。

Tip 1：高浓度的去垢剂会干扰免疫沉淀效果。所以可先用小体积RIPA裂解细胞制备蛋白裂解物，在开始IP捕获前，再补加1 X PBS或孵育液稀释到需要的体积。

Tip 2：使用足量的蛋白裂解物：单管IP实验，推荐裂解物初始体积为0.2–0.4 ml, 含1–3 mg总蛋白。可采用Bradford 或BCA法测定总蛋白浓度。

Tip 3：确保裂解液中添加了蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂用量可以是正常WB实验制样的1.5-2倍。

裂解物预处理（可选）

以45°角剪掉已灭菌枪头的末端，快速吸取重悬的Protein A sepharose beads悬液，加入含有裂解物的EP管中。通常1-3 mg总蛋白裂解物需加入30 μl 重悬的Protein A sepharose beads悬液。

Tip 4：以45°角剪掉已灭菌枪头的末端，防止beads堵塞枪头造成吸取不均。

• 4 °C旋转孵育60 min（推荐用垂直旋转混合仪，低速旋转）。

• 4 °C、500 g 离心1 min，将上清转入新的EP管中。

Tip 5：对于富含IgG的组织，推荐用Protein A或G beads预处理步骤。

免疫沉淀

• 吸取含有1-3 mg总蛋白的裂解物(或预处理）200-400 μl，加入EP管中，同时加入1-4 μg特异性抗体以及 150-300 μl 孵育液，最佳抗体数量应由抗体效价决定。另取等量蛋白裂解物，加入等量孵育液和等量同型IgG孵育作为Control IgG对照组。4°C ，旋转2–4h或过夜。

• 然后加入50 μl重悬的 Protein A 琼脂糖珠 ，4°C 旋转孵育1-4 h。

• 4 °C、500 g 离心30 s，弃上清。

• 每次用1 mL 1 × TBST（现加蛋白酶抑制剂）洗涤沉淀复合物，4 °C、500 g 离心30 s，吸弃上清；重复洗涤4-5次。最后一次洗涤/离心结束后，EP管中保留约80 ul 溶液（其余都吸弃）。

• 加20 μl  5x SDS Sample Buffer，重悬IP复合物beads，95–100oC 沸水浴 5 min , 然后8,000 g-10,000 g 离心3 minutes, 小心吸取上清转入新的EP管中。

WB 分析

• 将收集的IP样品加入SDS-PAGE对应泳道， 同样可以将剩余IP样品于-80 °C保存备用。 

• 通过SDS-PAGE分离IP样品，并将蛋白质向PVDF膜转移。使用合适抗体进行后续检测。

Tip 6:  对IP样品进行WB检测时，为了消除或减少样品中的抗体重轻链干扰，可用HRP-抗兔轻链特异性二抗或HRP-Protein A来代替传统WB二抗. (相比变性抗体，HRP-Protein A对天然完整抗体有更好亲和力)。

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