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免疫印迹 (Immunoblotting) 又称蛋白质印迹 (Western blot， WB)，是一种综合性的免疫学检测技术。它利用 SDS-PAGE 技术将生物样品中的蛋白质分子按分子量的大小在凝胶上分离开，然后用电转移的方法将蛋白转移到固相膜上，以固相膜上的蛋白质作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的第二抗体起反应，经过底物显色或荧光成像等方法以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白质。

1. 电泳:

a. 根据目标蛋白的分子量(MW)配置SDS-PAGE胶。（按照本文提出的建议和凝胶配方配制）

Tip 1 ：Tris-tricine gels比 Tris-glycine gel更好的分离低分子量蛋白 (<10 kDa)。

Tip 2 ：梯度胶可以提供更清晰的条带，在一种凝胶上提供更大的蛋白检测范围，如10-500kDa。

b. 在EP管中制备样品。添加4XSDS样品缓冲液，使每个样品的总蛋白质量为30-50μg（根据Bradford或BCA蛋白质分析测定的蛋白质量）。

c. 使用涡旋仪混合样品，然后加热至95-100°C5分钟。

d. 将凹槽中残留的胶清理干净，放置在电泳槽中，加入稀释好的电泳液。

2. 蛋白转移(以湿转为例）:

a. 推荐使用PVDF膜（只有当目标蛋白分子量<20kDa时，使用0.22μm孔径的PSQ膜）。将

膜在甲醇中浸泡30秒，用超纯水冲洗两遍，然后用转移缓冲液浸泡。将滤纸和海绵也浸泡在转移缓冲液中。

b. 将胶从电泳槽中取出，浸泡在移缓冲液中。

c. 以海绵/滤纸/膜/胶/滤纸/海绵的方式，将其紧密排列，确保各个夹层之间没有气泡。

d. 采用恒流法(一般是200mA，90min）进行电转。

e. 转移完成后，将膜取出，用超纯水冲洗两遍，放入封闭液（TBST+5%的脱脂奶粉）中进行封闭，室温两小时或4℃过夜。

Tip 3 ：如果目标MW大于150kDa，建议4°C湿转过夜，而且最好在转移缓冲液中添加0.005%SDS以便更好的转移大分子蛋白。

Tip 4 ：如果需要观察蛋白转移情况，可用丽春红染膜，观察完用TBST清洗干净。3. 免疫印迹:

a. 将膜从封闭液中取出，用1XTBST洗膜三次，每次5分钟。

b. 根据推荐稀释度用抗体稀释液稀释抗体，37℃孵育1小时或4°C过夜。

c. 用1xTBST清洗膜三次，每次10分钟。

d. 根据推荐稀释度稀释二抗，将膜放入其中孵育，37℃孵化1小时。

e. 用1xTBST清洗膜三次，每次10分钟。

f. 用超纯水将膜冲洗两遍。

Tip 5：在实验过程中的任何阶段都要保持膜的润湿状态。

4. 曝光:

a. 将ECL底物A液和B液1:1混匀后使用。

b. 将ECL底物和膜充分反应后，用保鲜膜将膜包裹固定在暗夹上。

c. 将膜暴露于暗照相膜或使用化学发光成像仪读取。

Tip 6：根据多次曝光时间来确定最佳曝光时间。

d. 在曝光后的胶片上备注信息，如：曝光时间，泳道和样品名称。

SDS PAGE 胶配方

1.常规胶配方

对于常规的大于10kDa蛋白，使用以下SDS-PAGE胶配方制备，根据分子量大小选择合适的胶浓度。配方如下：

分离胶（10 ml）
目的蛋白分子量 (kDa)	80-200	25-100	20-40	10-25
胶浓度	8%	10%	12%	15%
ddH₂O	3	2.5	2	1.25
40% 丙烯酰胺母液	2	2.5	3	3.75
2x 分离胶缓冲液母液	5.0	5.0	5.0	5.0
10% 过硫酸铵母液	0.1	0.1	0.1	0.1
TEMED	0.01	0.01	0.01	0.01

浓缩胶 (ml)	4 ml	6ml	8ml
目的蛋白分子量 (kDa)	-	-	-
胶浓度	4%	4%	4%
ddH₂O	1.6	2.4	3.2
40% 丙烯酰胺母液	0.4	0.6	0.8
2x 浓缩胶缓冲液母液	2.0	3.0	4.0
10% 过硫酸铵母液	0.04	0.06	0.08
TEMED	0.004	0.006	0.008

2x 分离胶缓冲液 (1000ml)
Tris	90.8 g
SDS	2.0 g
充分溶解后，用浓盐酸将PH调到8.8，然后用超纯水将体积补足到1000 ml。

2x 浓缩胶缓冲液 (1000 ml)
Tris	30.3 g
SDS	2.0 g
充分溶解后，用浓盐酸将PH调到6.8，然后用超纯水将体积补足到1000 ml。

SDS PAGE 电泳缓冲液

1x电泳缓冲液 ( 1000 ml)
Tris	3.03 g
甘氨酸	18.75 g
SDS	1 g
充分溶解后，用超纯水将体积补足到1000ml。

2. Tris-Tricine 胶配方

对于分子量小于10KDa的，建议使用Tris-Tricine胶体系。

配方如下:

Reagents	浓缩胶	间隙胶	分离胶
胶浓度	4%	10%	15%
体积	2 ml	1.5 ml	6 ml
37% 甘油母液	-	-	1.63 ml
ddH₂O	1.51 ml	0.595 ml	-
40% 丙烯酰胺母液	0.2 ml	0.375 ml	2.25 ml
3M Tris HCl (pH 8.5)母液	-	0.5 ml	2.0 ml
1M Tris HCl (pH 6.8)母液	0.25 ml	-	-
10% SDS母液	0.02 ml	0.15 ml	0.06 ml
10% APS母液	0.02 ml	0.015 ml	0.06 ml
TEMED	0.002 ml	0.0015 ml	0.003 ml